目录

第 1 章 仪器系统配置 ........................................................................................ 1

第 2 章 乳制品中三聚氰胺检测 ........................................................................ 2

2.1 三聚氰胺的基本性质和检测方法 ............................................................................ 3

2.2 按 GB/T 22388-2008 方法检测 .............................................................................. 4

2.3 按 GB/T 22100-2008 方法检测 ............................................................................ 13

第 3 章 乳制品中免疫球蛋白 IgG 检测 .......................................................... 19

3.1 样品预处理 .............................................................................................................. 19

3.2 色谱条件 .................................................................................................................. 19

3.3 谱图结果 .................................................................................................................. 19

第 4 章 牛奶中硫氰酸钠的检测 ...................................................................... 20

4.1 试剂及相关溶液配制 .............................................................................................. 20

4.2 样品前处理 .............................................................................................................. 20

4.3 色谱条件 .................................................................................................................. 21

4.4 谱图结果 .................................................................................................................. 21

第 5 章 乳制品中维生素的检测 ...................................................................... 22

5.1 HPLC 法测定维生素含量的标准 ........................................................................... 22

5.2 仪器配置简表 .......................................................................................................... 23

5.3 维生素 A 的含量测定 ............................................................................................. 24

5.3.1 反相高效液相色谱法 .............................................................................................. 24

5.3.2 正相高效液相色谱法 .............................................................................................. 26

5.3.3 紫外分光光度计法 .................................................................................................. 27

5.4 维生素 D 的含量测定 ............................................................................................. 29

5.4.1 反相高效液相色谱法 ............................................................................................. 29

5.4.2 正相高效液相色谱法 ............................................................................................. 32

5.5 维生素 E 的含量测定 ............................................................................................. 33

5.5.1 反相高效液相色谱法 ............................................................................................. 33

5.5.2 正相高效液相色谱法 ............................................................................................. 35

5.6 维生素 B1 的测定 ................................................................................................... 37

5.7 维生素 B2 的测定 ................................................................................................... 38

5.8 维生素 B3 (烟酸和烟酰胺) 的测定 .................................................................... 39

5.9 泛酸的测定 .............................................................................................................. 41

5.10 维生素 B6 的测定 ................................................................................................... 42

5.11 维生素 K1 的测定 ................................................................................................... 43

5.12 叶酸的测定 .............................................................................................................. 45

5.13 维生素 B12 的测定 ................................................................................................. 46

附录 1 维生素标准溶液校正方法 ..................................................................................... 48

第 1 章 仪器系统配置

EClassical 3200 高效液相色谱系统，是依利特设计开发的具有自主知识产权的新型高效液相色谱仪，集聚了依利特多年来技术的传承、经典的延续，并且含有多个创新专利技术，在满足不断升级的法规要求的同时，又重新定义国产液相的外观设计，完善分析过程中的自动性、连续性、完整性，展现实际选择时的灵活性、实验室结果的稳定性，满足了实验室低成本、高效率运行的可行性。

第 2 章 乳制品中三聚氰胺检测

大连依利特分析仪器有限公司作为国内知名厂家，秉承着 “质量更佳、服务更优、创新更快” 的理念，二十年来为食品安全、药品检测及高校应用等众多行业提供着完善的分析方法及先进的仪器配置。从苏丹红、孔雀石绿到 “三鹿奶粉三聚氰胺” 事件，关系着国计民生的 “食品安全” 问题一次次为我们敲响警钟，并引起社会广泛关注。针对 “三聚氰胺” 事件，依利特人在第一时间做出反应，荣获由国家认证认可监督管理委员会颁发的 “能力验证合格实验室证书”，并且按照 GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》、GB/T 22400-2008《原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法》的国家标准，在经过大量实验验证后，提供出符合国标的三聚氰胺检测解决方案，包括分析方法验证及推荐仪器配置在内的全套解决方案。

2.1 三聚氰胺的基本性质和检测方法

三聚氰胺（英文名 Melamine），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料，简称三胺，分子式\(C_3N_6H_6\)、\(C_3N_3(NH_2)_3\)，分子量 126.12。

三聚氰胺是一种低毒的化工原料。动物实验结果表明，其在动物体内代谢很快且不会存留，主要影响泌尿系统。

由于食品工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被人们称为 “蛋白精”。

三聚氰胺是强极性化合物，在传统的反相 C18 色谱柱上保留很差，通常采用离子对试剂使其良好的保留。因此，反相离子对模式是为常用的分析三聚氰胺分离模式之一。

此外，在酸性条件下，三聚氰胺分子易带上正电荷，离子交换模式对其有良好的选择性，在实际运用中也有不错的效果。

2.2 按 GB/T 22388-2008 方法检测

试样用三氯乙酸溶液 - 乙腈提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定。

2.2.1 试剂配制

流动相

1. 离子对试剂缓冲液：准确称取 2.10g 柠檬酸和 2.16g 辛烷磺酸钠，加入约 980mL 水溶解，调节 pH 至 3.0 后，定容到 1L，并用 0.45μm 水系微孔滤膜过滤备用。
2. 用量筒分别量取 900mL 离子对试剂缓冲液和 100mL 乙腈，混合均匀，超声脱气 10min。

注意：称取辛烷磺酸钠时，需注意其分子量，若含有结晶水，则需换算。如某辛烷磺酸钠（\(C_8H_{17}O_3S·H_2O\)，分子量 234.29），则配制流动相时，该种离子对试剂的称取量应为 2.34g。注意：离子对缓冲液在不调 pH 值以前，其 pH 值应低于 3.0，因此应选用碱性溶液调整至 3.0，此环节建议采用 2mol/L NaOH 溶液作为 pH 调整用试剂。注意：选用标准量筒量取两种液体，保证量具本身的准确性；不要采用容量瓶混合缓冲液与乙腈然后定容。

三聚氰胺标准品储备液

准确称取 100.0mg（精确到 0.1mg）三聚氰胺标准品于 100mL 容量瓶中，用 50% 甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为 1mg/mL 的标准储备液，于 4℃避光保存。

标准系列可采用上述储备液，用流动相逐级稀释。

注意：标准储备液可存放 1~2 个月，标准系列有效期一般为 1~2 周，好现用现配；配制标准系列时，建议采用同一厂家同一批次的容量瓶或将容量瓶标定后使用，以保证标准系列的线性。

1% 三氯乙酸溶液

准确称取 10g 三氯乙酸于 1L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。

5% 氨化甲醇溶液

准确量取 5mL 氨水和 95mL 甲醇，混匀后备用。

注意：确保氨水有效期，以免由于存放时间过长造成挥发，使得有效成分缺失。

2.2.2 样品前处理

蛋白沉淀

称取 2.00g（精确至 0.01g）试样于 50mL 具塞塑料离心管中，加入 15mL 1% 三氯乙酸溶液和 5mL 乙腈，超声提取 10min，再振荡提取 10min 后，以不低于 4000r/min 离心 10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至 25mL，移取 5mL 滤液，加入 5mL 水混匀后做待净化液。

注意：为了获得佳的离心效果，如果离心机转速允许，可以设定转速为 8000~10000r/min；过滤时，需控制速度，且过滤后需少量多次用 1% 三氯乙酸溶液洗涤滤纸以保证回收率；若离心效果理想，上清液非常澄清，可省略过滤环节，避免样品损失；当样品脂肪含量较高时，需参照 GB/T 22388 先进行液 - 液分配除脂后，再进行净化。

样品净化

依次用 3mL 甲醇和 5mL 水将固相萃取小柱活化。将上节中的待净化液转移至固相萃取柱中。依次用 3mL 水和 3mL 甲醇洗涤，抽至近干后，用 6mL 氨化甲醇溶液洗脱。洗脱液于 50℃下用氮气吹干，残留物（相当于 0.4g 样品）用 1mL 流动相定容，涡旋混合 1min，过 0.45µm 油系微孔滤膜后，供 HPLC 测定。

注意：整个固相萃取过程流速不超过 1mL/min；上柱过程中要避免气泡上柱，一旦气泡进入小柱，将大大影响样品的回收率。

2.2.3 色谱条件

• 色谱柱：Elite MSP C18 柱 5μm 4.6×250mm
• 流动相：离子对试剂缓冲液 / 乙腈 = 90/10（v/v），混匀
• 流速：1.0mL/min
• 检测波长：240nm
• 进样体积：20μL
• 柱温：40℃

注意：由于大多数仪器配置均为 7725i 手动进样阀，定量环体积 20μL。为了获得更为准确的测试结果，建议采用满定量环的进样方式，即进样量为 5 倍或 5 倍以上定量环体积。

2.2.4 典型谱图

2.2.5 性能指标

线性范围

标准系列浓度分别为：0.8、2、20、40、80µg/mL，线性相关系数为 0.9996。

样品测试过程中，应保证其三聚氰胺含量在该线性范围之内，若超出该范围，需将样品进一步稀释或浓缩。

方法检出限和方法定量限

样品测试过程中，应保证其三聚氰胺含量在该线性范围之内，若超出该范围，需将样品进一步稀释或浓缩。

方法检出限和方法定量限

此为方法检出限，并已将前处理样品稀释倍数考虑在内；检出限、定量限与检测器自身的灵敏度及噪声大小有关，不同检测器测试结果会存在一定差异。

SPE 小柱加标回收率

方法准确性

方法稳定性

将同一未知样品一分为三，连续测试结果如下：

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后续章节详情：第 2.3 节（GB/T 22100-2008 方法检测）至第 5 章（乳制品中维生素检测）、附录 1（维生素标准溶液校正方法）的完整内容；

高清资料：所有章节谱图（图 2-1 至图 5-5）高清版（含峰形放大细节、基线噪声标注）、实际乳制品样品（奶粉、鲜奶、蛋糕卷）检测原始谱图；

验证数据：各检测项目（三聚氰胺、IgG、硫氰酸钠、维生素）的线性方程、检出限 / 定量限报告、加标回收率数据（88%-104%）、精密度验证结果（RSD＜2%）；

操作指南：固相萃取 / 液液萃取操作视频、维生素衍生化反应实操演示、色谱柱活化与维护细则；

附录文件：GB/T 22388-2008、GB 5009.82-2016 等标准原文节选、仪器校准证书模板、耗材订货清单（色谱柱、试剂、滤膜型号编码）。

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技术咨询：400-66-35483