进样是HPLC整套分析流程的咽喉，样品从样品瓶进入色谱流路全部依靠进样系统完成。很多人觉得进样只是简单放样品瓶、点击运行，其实大量细节会直接影响数据重复性，操作不当不仅会造成整批样品实验作废，还会磨损进样阀密封垫、堵塞定量环，缩短昂贵色谱柱的使用寿命。

结合日常实验室实操经验，下面完整梳理高效液相色谱仪进样全套操作流程、避坑要点，以及高频故障快速处理方案，不管是新手操作人员，还是需要做SOP参考，都可以直接拿来对照使用。

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一、高效液相色谱仪进样标准操作流程

整套进样操作分为上机前准备、上机核心操作、实验结束后收尾维护三大模块，每一步都不能省略。

1.上机前万全准备

上机准备是减少后期故障重要的一步，很多液相异常，在样品还没上机就已经埋下隐患。

1）样品预处理

样品必须充分溶解，肉眼观察无沉淀。反相体系采用0.22 μm HPLC专用滤膜过滤，正相体系选用0.45 μm滤膜，过滤是保护色谱柱硬性要求，哪怕样品溶液看着澄清透亮，也必须过滤去除微小颗粒杂质，避免颗粒物刮伤柱头筛板，造成柱压持续走高、柱效快速下降。过滤完成之后可以3000r/min离心5分钟，震掉溶液里面微小气泡。

2）样品瓶规范处理

选用液相专用螺纹样品瓶，装样液位控制在瓶身1/2‑2/3。液位太低，自动进样针容易吸空；装液过满，运行过程容易漏液，造成交叉污染。瓶盖、进样隔垫做到一瓶一套，严禁混用，隔垫出现划痕、破损要及时更换。摆放至样品盘时瓶签朝外，核对样品盘位置编号，防止错放样品。

3）仪器状态核查

确认流动相储量充足，已经完成过滤脱气；检查管路没有残存气泡；等待系统基线平稳，基线噪声≤0.1mV，漂移≤0.5mV/h；柱温箱升温达到设定实验温度，仪器状态显示就绪，才可以进行进样序列编辑。

2.上机核心进样操作

1）工作站方法参数设置

在色谱工作站录入完整方法：进样体积、洗针溶剂、洗针次数、洗针时间、流速、柱温等参数。使用定量环做定量分析，常规建议进样体积不超过定量环容量50%，举例20μL定量环，进样体积控制≤10μL，大化保障进样重复性。

2）建立样品运行序列

仔细填写样品编号、样品盘位置、样品名称。数据文件命名建议采用「日期‑项目‑样品编号」格式，后续数据溯源查找更方便，避免大量数据文件混杂无法区分。

3）运行前隐患排查

查看废液瓶液位，不要超过80%刻度，废液过满会发生倒吸，污染进样阀和整个流路；确认自动进样器舱门完全关紧，无松动。

4）启动序列，实时监测运行状态

点击序列开始运行，观察第一针进样时系统压力小幅波动、基线轻微抬升，代表样品已经成功注入流路。如果压力完全不动、基线没有任何响应，立刻停止序列，排查吸样、进样阀故障，不要继续跑样。

3.实验后收尾与部件保养

很多实验室做完实验直接关机，忽略进样系统维护，久而久之就会出现鬼峰、交叉污染、定量环堵塞。

1）进样针清洗保养

序列全部跑完之后，将洗针瓶更换为90%水+10%甲醇清洗液，执行自动洗针程序，重复洗针3‑5次，冲掉针管壁吸附样品，防止样品干涸结晶堵塞针头。

2）流路与进样阀专项冲洗

如果本次分析过高盐缓冲体系、高粘度或者强极性样品，不能直接用纯有机相冲洗。先纯水或者低盐溶液冲洗进样阀、定量环、流路10‑15min，把盐类物质充分冲洗干净，之后再切换甲醇或者乙腈做保存冲洗，杜绝盐结晶损坏部件。

3）耗材与数据整理

第一时间备份全部实验数据，防止电脑故障数据丢失；取出样品盘所有样品瓶，清洗晾干收纳；擦拭进样器腔体，清除溅落的残留溶剂。

二、高效液相进样四大核心避坑要点

要点1：严防交叉污染，保证数据纯净度

交叉污染是液相定量实验头疼的问题，高浓度标样残留带入低浓度样品，直接导致结果偏高。

禁止操作：高浓度样品结束直接跑低浓度样品；瓶盖隔垫反复混用；洗针次数设置过少。

实操规范：高浓度样品、标准品测试完毕，加大洗针次数至5‑8次，延长洗针浸泡时间；洗针溶剂选择洗脱能力较强甲醇、乙腈混合溶剂；样品瓶使用前甲醇超声清洗烘干再装样；隔垫一旦出现磨损、污渍立刻换新，隔垫是交叉污染高频来源。

要点2：把控进样精度，保障结果重复性

峰面积RSD偏大，很多情况不是仪器硬件故障，而是样品引入环节细节不到位。

禁止操作：样品内部残留气泡；样品溶剂和流动相洗脱强度差距过大；进样体积超过定量环负载。

实操规范：样品过滤后离心或者轻弹瓶壁排出气泡；样品溶解溶剂尽量选用流动相初始配比；实在溶解性受限，有机相差值尽量控制在20%以内，规避溶剂效应，避免峰前延、分叉；不能超过定量环大允许进样量，防止定量失真。

要点3：保护进样部件，延长色谱仪、色谱柱寿命

进样阀密封垫、定量环都属于消耗件，规范操作可以大幅降低更换频次。

禁止操作：样品不经过滤直接上机；忽视密封垫损耗；长期不对定量环拆解清洗。

实操规范：样品过滤是硬性底线，即使溶液澄清也不能跳过；进样阀转子密封垫，一般2000‑5000次进样后建议检查更换；一旦发生压力异常波动、进样口渗漏，立刻停机更换；建议每月拆解清洗一次定量环，去除管壁吸附杂质。

要点4：实验安全操作规范

禁止操作：带压状态拆装进样器部件；不带防护处置有毒样品；实验废液直接倾倒下水道。

实操规范：拆卸管路、检修进样阀，务必先卸除系统压力，防止高压溶剂喷溅；有毒、腐蚀性样品全程通风橱操作，佩戴丁腈手套、护目镜；所有实验废液分类收集，交由合规机构处理。

三、HPLC进样相关常见现象、原因以及快速解决

规范进样，让HPLC分析事半功倍

高效液相色谱分析，七分操作，三分仪器，而进样操作正是整个实验的「咽喉环节」。将标准化流程内化为操作习惯，把避坑要点牢记于心，不仅能获得峰形对称、数据精准、重复性优异的实验图谱，更能大幅减少仪器故障，延长色谱柱、进样阀等核心部件的使用寿命，提升实验效率。

细节决定成败，从每一次规范进样做起，让你的HPLC分析工作告别数据异常、仪器故障，全程得心应手！

很多实验人员把精力放在优化流动相配比、调整梯度程序，却忽略进样操作细节，反复遇到数据异常，消耗大量时间反复复测。把进样整套流程固化为日常操作习惯，既能拿到峰形对称、RSD合格的色谱图谱，也能减少仪器故障，降低色谱柱、进样阀配件损耗，提升整体实验室工作效率。

本文由依利特液相售后技术整理，适用于大部分国产高效液相色谱仪自动进样器操作参考，不同品牌工作站界面略有差异，操作逻辑相通。

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