摘要：本文结合实验室实操经验，整理高效液相色谱仪（HPLC）完整标准化操作流程，涵盖开机准备、系统平衡、样品检测、数据处理、关机冲洗全步骤。结合日常实操痛点，汇总流动相、缓冲盐、色谱柱、进样操作的关键禁忌与规范，同时整理压力异常、基线不稳、峰形异常、鬼峰、保留时间漂移等常见故障的实操排查方法，可直接作为实验室HPLC上机SOP使用，规范操作流程、降低仪器故障率、保证检测数据准确可靠。

一、目的

统一实验室高效液相色谱仪的操作、维护标准，规范全员上机流程，避免因操作不规范导致的数据偏差、色谱柱损坏、管路堵塞、仪器故障等问题。保障每次检测数据的准确性与重复性，保证仪器长期稳定运行，有效延长设备及色谱柱的使用寿命。

二、适用范围

本规程适用于实验室所有操作人员，包含药品检测、食品检测、水质环境监测、化工原料分析、科研实验等所有HPLC检测场景，仪器日常使用、方法调试、设备维护均可参照执行，所有上机人员必须熟练掌握并严格遵守。

三、安全注意事项

1、个人防护

所有液相操作全程必须穿戴实验服、耐有机溶剂手套及防护眼镜。甲醇、乙腈、酸碱缓冲液均有刺激性与毒性，禁止裸手接触、直面挥发气体。操作结束及时清洁手部及操作台，杜绝实验安全风险。

2、溶剂安全

HPLC常用有机试剂易燃、易挥发且具有毒性，所有溶剂配制、流动相更换、废液处理操作必须在通风橱内完成。缓冲盐水溶液长期放置容易长菌、变质、产生沉淀。实验废液、废流动相、废弃样品需分类收集，严禁随意倾倒，按实验室危废管理制度统一处理。

3、压力安全

液相系统属于高压设备，严禁超耐压上限运行。上机前务必确认泵体、管路、色谱柱的耐压参数，设定合理压力上下限。开泵前必须确认流路通畅、排空阀拧紧，防止压力瞬间飙升造成管路崩裂、泵头损坏、色谱柱受压失效。

4、用电安全

仪器必须可靠接地，避免静电干扰基线稳定性。严禁试剂渗漏至电源接口、电路及仪器主板位置，定期检查电源线是否老化、破损。仪器出现故障时，禁止带电拆机检修，必须断电后再排查处理。

5、色谱柱保护

严格按照色谱柱说明书匹配流动相pH、溶剂体系，不得使用超范围强酸、强碱溶剂。所有进样样品必须提前溶解、过滤，杜绝固体杂质进入柱体，避免色谱柱堵塞、柱头塌陷、柱效快速下降。

四、关键操作注意事项

1、流动相“三必须”

必须使用色谱纯溶剂和超纯水：严禁使用分析纯、工业级试剂及普通纯水，杂质和离子会直接造成基线漂移、噪音偏大、鬼峰频发、系统堵塞，严重影响检测数据。

必须过滤处理：所有流动相需使用0.45 µm或0.22 µm滤膜过滤，去除微小颗粒杂质，防止堵塞泵头、在线过滤器和色谱柱流路。

必须超声脱气：流动相使用前充分超声脱气，去除水中溶解空气，避免气泡进入管路，引发压力波动、基线跳动、出峰异常等问题。

2、缓冲盐“三忌”

忌存不冲：使用缓冲盐实验结束后，绝对不能直接关机。需先用高比例水相冲洗30分钟以上，彻底置换管路、泵头、色谱柱内残留盐分，再切换有机相保存，防止盐结晶堵管。

忌现配不用：缓冲盐溶液必须现配现用，放置时间过长会滋生细菌、产生絮状沉淀、溶液变质，直接污染整个液相系统。

忌高低浓度直接混合：高浓度缓冲盐与高比例有机相不能直接混合，极易析出盐结晶，必须采用梯度过渡方式混合，避免堵柱、堵管路。

3、色谱柱“三核心”

流向正确：色谱柱安装必须遵循柱体箭头流向，禁止反接使用，反接会造成柱效快速下降、固定相流失，缩短色谱柱使用寿命。

保存规范：仪器长期不用时，需用纯甲醇或乙腈充分冲洗色谱柱，将柱体保存在纯有机相中，两端密封保存，防止柱体干裂、污染。

溶剂兼容：实验前核对流动相pH、溶剂类型，确保与色谱柱固定相匹配，不超参数范围使用，避免造成不可逆的柱体化学损伤。

4、样品“两匹配”

溶剂强度匹配：溶解样品的溶剂强度不能高于初始流动相，否则会导致峰分叉、拖尾、峰形畸变，影响积分和定量结果。

样品状态匹配：样品必须完全溶解、澄清透明，进样前务必过滤，避免不溶杂质污染进样针、定量环和色谱柱。

5、关机“一绝对”

绝对禁止带盐直接关机：只要实验使用过缓冲盐体系，必须先水相冲洗除盐，再有机相养护，严禁直接关机，这是液相设备日常养护的核心要点。

五、标准操作流程

（一）开机前准备

提前检查实验室环境，温度维持在15-30℃，环境湿度稳定无凝露。提前配制流动相，完成过滤、超声脱气，缓冲盐溶液随配随用。样品充分溶解、稀释，选用与初始流动相近的溶剂配制并过膜处理。检查废液瓶余量、管路是否漏液、色谱柱连接是否牢固，确认仪器整体状态正常后方可开机。

（二）开机与系统初始化

遵循逐级开机顺序：先开稳压电源，再依次开启电脑、检测器、自动进样器、柱温箱，后打开输液泵。启动液相工作站，等待设备自动自检完成，确认各模块连接正常、无报错提示，进入待机状态。

（三）方法编辑与参数设置

根据检测标准在工作站设置实验参数：设定流动相配比、泵流速、系统压力上下限；设置检测器波长、采样频率；设定柱温箱恒温温度；调试自动进样器进样体积、洗针程序；设置样品运行时长，保存完整实验方法。

（四）系统平衡

打开排空阀，对各流动相通道进行Purge排气，彻底排净泵头与管路内气泡，排气完成后拧紧排空阀。调用实验方法，以初始流动相条件持续平衡系统，观察基线和压力状态，待基线平直、压力稳定无波动后，方可开始进样检测。

（五）样品分析

将预处理完成的样品有序摆放至自动进样器样品位，在工作站编辑样品检测序列，标注样品名称、序号。保存并启动序列运行，实验过程中实时监控基线、压力和出峰状态，出现异常及时停机排查，防止批量数据作废。

（六）数据处理与报告生成

样品检测完成后，对色谱图进行积分校准、数据统计计算，剔除异常数据。核对图谱与数据无误后，生成正式检测报告，妥善保存原始数据和图谱，做好实验溯源记录。

（七）规范关机流程

含缓冲盐体系：先用超纯水低速冲洗系统30分钟以上，彻底置换系统内缓冲盐，再切换甲醇或乙腈冲洗30分钟以上，完成设备养护。

无缓冲盐纯有机体系：直接使用甲醇、乙腈冲洗系统15分钟以上，稳定流路状态。

冲洗完成后将泵流速调至0，在软件内关闭各设备模块，再依次关闭硬件电源、稳压电源。如实填写仪器使用记录，标注使用时间、实验内容及仪器运行状态。

六、仪器日常维护保养

输液泵维护：定期检查泵头、密封圈使用状态，根据上机频次定期更换密封圈，防止泵头漏液、压力不稳、输液精度偏差。

自动进样器维护：定期清洗进样针、定量环和洗针管路，按需更换转子密封垫，避免样品残留、交叉污染，保证进样精准度。

检测器维护：记录氘灯、钨灯使用时长，累计使用超2000小时及时更换光源，避免光源老化导致基线噪音大、响应值低、检测灵敏度下降。

色谱柱维护：每次实验结束按规范充分冲洗柱体，去除残留样品和盐分，密封妥善保存。定期检测柱效，对污染、老化色谱柱及时冲洗再生或更换。

七、常见问题原因分析与排查解决方法

1、系统压力异常偏高

故障原因：大多为流路堵塞导致，常见于保护柱、在线过滤器、色谱柱污染堵塞；使用缓冲盐流动相时，盐结晶析出也会造成管路和柱体堵塞，引发压力骤升。

解决方法：优先检查、清洗或更换保护柱；若压力未恢复，依次排查在线过滤器和色谱柱，设备支持的情况下可反向冲洗除堵；盐析堵塞需用高比例水相低速长时间冲洗，溶解结晶盐分，恢复流路通畅。

2、系统压力过低或剧烈波动

故障原因：主要为管路混入气泡、接头松动漏液、泵头密封件老化失效，造成输液不稳定、压力忽高忽低或整体压力偏低。

解决方法：对所有流动相通道重新彻底Purge排气；逐一检查泵头、管路接头、进样器接口，拧紧松动位置，更换老化密封配件，彻底解决漏液问题。

3、基线噪音过大、基线不稳

故障原因：检测器光源老化、氘灯超期使用；流动相未脱气、变质污染；检测器流通池残留气泡或杂质。

解决方法：查看光源使用时长，超期及时更换氘灯；重新配制新鲜流动相，过滤并充分脱气；提高流速冲洗检测器流通池，排净气泡，稳定基线状态。

4、色谱峰拖尾、峰分叉

故障原因：色谱柱污染、柱效下降；样品溶剂强度高于初始流动相，造成进样峰形畸变；管路接头匹配度差、存在死体积。

解决方法：用标准品校验柱效，柱效不足时冲洗再生或更换色谱柱；调整样品溶剂，保证溶剂强度不高于初始流动相；重新紧固色谱柱两端管路，消除死体积，优化流路。

5、检测出现鬼峰

故障原因：流路残留旧样品杂质、流动相变质污染；自动进样器洗针不彻底，造成样品交叉污染，空白进样也会出现杂峰。

解决方法：做空白进样判断污染来源；使用强溶剂梯度冲洗整条流路；更换全新流动相；调高自动进样器洗针次数与洗针液用量，避免交叉污染。

6、色谱峰保留时间持续漂移

问：样品检测时，前后批次色谱峰保留时间不一致、持续偏移，该怎么处理？

答：这种情况大多是系统平衡不足、流动相变化或柱温波动导致。更换流动相后平衡时间不够、易挥发流动相配比改变、柱温箱温度不稳、色谱柱固定相流失，都会造成保留时间漂移。实操中需延长系统平衡时间，待基线、压力完全稳定再进样；易挥发流动相密封保存、现配现用；锁定柱温箱恒温参数；漂移严重时冲洗再生色谱柱，柱效老化严重则直接更换。

7、进样后不出峰、无目标色谱峰

问：仪器运行正常、进样流程无误，但检测全程没有目标色谱峰，如何排查？

答：主要分为样品、仪器、方法三类问题。样品方面可能是浓度过低、样品降解失效、未完全溶解；仪器方面多为检测器波长设置错误、光源未点亮；方法方面为流动相配比不适、出峰时间超出设定运行时长。可重新配制样品复测，核对检测器参数与光源状态，适当延长运行时长、优化流动相比例，适配目标物质出峰条件。

8、色谱峰峰宽过大、峰形展宽

问：样品可以正常出峰，但峰宽偏大、峰形展宽、组分分离度下降，影响定量结果，该如何解决？

答：一般由流速偏低、样品过载、色谱柱污染老化、管路死体积过大导致。实操中可核对并调整至标准流速，减少单针进样量避免样品过载；彻底冲洗污染色谱柱恢复柱效；统一匹配管路内径、紧固接头，消除死体积，改善峰形与样品分离度。